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ざっくり読んでみた①感染研コロナ論文

日本の国立感染症研究所のコロナ論文海外の科学者、ジャーナリストなどが検証の対象にしているのを正直見たことがありません。
海外で検証の対象になっているのは中国の初期の3つの論文、豪、米CDC、韓国、香港の論文などです。(どれも内容は科学的に否定されています)


当然どこか海外の公的機関が情報公開の回答に感染研論文を存在証明として出しているのも見たことがありません。(各国の回答はほとんど「記録・文書なし」ですが、たまに「ある」として出されるとすれば主に中国論文(NEJM)、または米CDC論文です)


その感染研の論文、当の感染研さえも開示請求に対しては「行政文書なし」として出しません👇

※「分離した事を立証」これが大事なところです


しかしメールで問い合わせるとこうして出します👇

Enhanced isolation of SARS-CoV-2 by TMPRSS2-expressing cells


つまり存在証明とはウイルス分離のことです。なぜ分離が必要なのでしょうか👇


📞でも論文のありかを確認👇

宮原さん「感染研が1月31日に分離したっていう論文はどこにあるんですか?」8:00~
感染研職員「Enhanced isolation of SARS-CoV-2 by TMPRSS2-expressing cellsというタイトルの論文で、筆頭著者が感染研の松山先生になるものです」9:00~
(タイトルをすごい早口で読み上げます)


2020年1月31日のこの👇発表、その元になった論文のことです。
このページにどうしてその論文へのリンクを貼らないのでしょうか?

「分離に成功HP」からは飛べず、開示請求に対しては不開示、メールや電話でのみ教えてもらえる日陰の存在的なこの論文ですが、それでもこれがおそらく日本で唯一の正式な「コロナの存在証明」です。(当然行政文書のはず)


そこで今回はこの論文を一度じっくり(ざっくり)見てみようと思います。
これが感染研の「コロナ分離論文」ですが👇本当にコロナを分離したのでしょうか?
Enhanced isolation of SARS-CoV-2 by TMPRSS2-expressing cells
(TMPRSS2発現細胞によるSARS-CoV-2の分離の促進)


執筆者18名中16名が感染研職員です。かわせみゆき氏、忽那賢志氏の名もあります

タイトルにあるTMPRSS2発現細胞とはVero細胞(アフリカミドリザル🐒の腎臓細胞)の一種です。
ここからわかるのは行ったのは「細胞培養」であり、実際の分離ではないということですこれは感染研だけでなく世界中すべてのウイルス分離論文がそうです

それではここから感染研論文の訳の一部をじっくり見て見ましょう。


まずどの論文にも形式として最初にAbstract(概要)があり、「コロナ発生」のいきさつが説明されます👇


【Abstract】
A novel betacoronavirus, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), which caused a large respiratory outbreak in Wuhan, China in December 2019, is currently spreading across many countries globally.
【概要】
2019年12月に中国・武漢で大規模な呼吸器感染症を引き起こした新型ベータコロナウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、現在世界各国で感染が広がっている。・・・


この論文にはそれ以外細かい項目はなく(他国の論文だとたいてい「ウイルス分離」という項目があるのですが)、第3段目から何となく?分離の話が始まります👇


①ウイルス分離ではなく細胞培養
SARS-CoV-2 is isolatable using VeroE6, Huh7, or human airway epithelial cells (2⇓–4), but here we show that an engineered cell line, VeroE6/TMPRSS2, is highly susceptible to SARS-CoV-2 infection, suggesting the important role for TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infection and indicating its potential utility for isolating and propagating this virus.
SARS-CoV-2は、VeroE6、Huh7、ヒト気道上皮細胞(2⇓-4)を用いて分離可能であるが、ここでは人工細胞株であるVeroE6/TMPRSS2がSARS-CoV-2に非常に感受性があることを示し、SARS-CoV-2の感染におけるTMPRSS2の重要性を示唆するとともに、本ウイルス分離増殖に有用であることを示唆するものである。


VeroE6/TMPRSS2とはVero細胞(アフリカミドリザル🐒の腎臓細胞)の改良品なので、ここでやっている実験は細胞培養であってウイルス分離ではありません。この時点でこの論文は終了なのですが、他にも問題点がありますので続けます。


(参考)モレル、コーワン、カウフマン:ウイルス分離についての声明
今後、SARS-CoV-2ウイルスが分離されたことを示唆する論文が出てきたら、方法のセクションを確認してほしい。もし研究者がVero細胞や他の培養法を使ったのであれば、彼らのプロセスが分離ではないことを知っているはずだ。


②調査対象は7人の患者のみ
Seven clinical specimens (throat swabs or sputum) obtained from seven SARS-CoV-2 infection cases were inoculated into VeroE6/TMPRSS2 cells, which were monitored daily for cytopathic effect (CPE). These clinical specimens were deidentified prior to use, and this study was approved by the ethics committee of the National Institute of Infectious Diseases, Japan (approval no. 1091).
SARS-CoV-2感染者7名から得た臨床検体(咽頭拭い液または喀痰)7個をVeroE6/TMPRSS2細胞に接種し、毎日細胞毒性(CPE)を観察した。これらの臨床検体は使用前に非識別化されており,本研究は国立感染症研究所倫理委員会の承認(承認番号1091)を受けている.


2020年1月半ばの時点で日本でもう7人の患者を見つけていたというのが謎です。
とは言えこういった実験は数百人規模でやらないといけないのです。
しかもまだウイルスの特徴や病状がはっきりする前にその人達が「コロナにかかっている」とどうしてわかったのでしょうか?


(参考)モレル、コーワン、カウフマン:ウイルス分離についての声明
新しいウイルスを分離し、特徴を明らかにし、実証するための適切な方法は以下の通りである。まず、病気を特徴づけるのに十分に特異的な症状を持つ多くの人(例えば500人)からサンプル(血液、喀痰、分泌物)を採取する。


③分離の手順に関する記載がほとんどない
今一番問題になっている分離に関する記述はこれだけです👇
Therefore, we attempted to isolate SARS-CoV-2 using VeroE6/TMPRSS2 cells, which express TMPRSS2 constitutively.
そこで、TMPRSS2を構成的に発現しているVeroE6/TMPRSS2細胞を用いて、SARS-CoV-2の分離を試みた。


分離の手順の説明が一切ありません。
他の論文だとこんなに詳しく書かれています。


例:米CDCのコロナ分離論文👇よりウイルス分離の項目
【細胞培養、限界希釈、およびウイルス分離】
分離と初期継代にVero CCL-81細胞を使用した。Vero E6Vero CCL-81、HUH 7.0、293T、A549、および EFKB3 細胞を、熱不活性化ウシ胎児血清(5% または 10%)および抗生物質/抗真菌剤(GIBCO、 https://www.thermofisher.comExternal Link)添加ダルベッコ最小必須培地 (DMEM) 中で培養した。


ウイルス分離には、NPとOPの両方のスワブ検体を使用しました。ウイルスの分離、限界希釈、継代1には、96ウェル組織培養プレートのカラム2〜12に無血清DMEMを50μLずつピペッティングし、カラム1に臨床検体100μLをピペッティングしてプレート全体で2倍に連続希釈した。次に、Vero細胞を10%ウシ胎児血清2×ペニシリン/ストレプトマイシン、2×抗生物質/抗菌薬、2×アンフォテリシンBを含むDMEMに2.5×105 cells/mLの濃度でトリプシン処理し再懸濁させた。細胞懸濁液100μLを臨床検体希釈液に直接添加し,ピペッティングにより穏やかに混合した。その後,接種した培養液を5% CO2雰囲気の加湿37℃インキュベーターで培養し,毎日細胞毒性(CPE)の有無を観察した。SARS-CoV-2のプラークアッセイは、SARS-CoVおよび中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)のプロトコルに基づく標準的なものを使用した(9,10)。


CPEが観察された場合、ピペットチップの背で細胞単層膜を掻き取った。ウイルス溶解液50μLを全核酸抽出に使用し、確認試験とシークエンスに使用した。また、90%コンフルエント24ウェルプレートの1ウェルへの接種には、50μLのウイルス溶解液を使用した。


CDCもVero細胞を使っているので分離ではなく細胞培養なのですが、感染研論文がいかに大事な部分を省略しているかがわかります。


感染研の分離手順詳細は論文とは別のところにあります👇
「感染研・地衛研専用」SARS-CoV-2遺伝子検出・ウイルス分離マニュアルver1.0
【ウイルス分離法】より

使用するものはCDCのとほぼ被っています。
(Vero細胞、ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、アンフォテリシンB、トリプシンなど)
「ウイルス分離方法」は世界共通なので当然なのですが。


ゲンダマイシンアンホテリシンとは
トム・コーワン博士が言っていたこれです👇


しかも、腎臓に毒性があることが知られている2種類の強力な薬剤(ゲンタマイシンアンフォテリシン)を加えて初めて「感染」するのである。
これまで何度も指摘してきたように、組織を飢えさせたり毒殺したりしない限り、このような接種で組織が死ぬ(溶ける)ことは示されていない。


これら薬剤のせいでVero細胞が壊れ始めたことを「ウイルス増殖によるもの」と解釈するのが「細胞培養」で、しかもそれを論文などで発表する時には「分離」と呼んでいるのです。


④新開発Vero細胞の優位性のPRが内容の中心
この論文はVeroE6/TMPRSS2細胞という日本で新開発のVero細胞の優位性のPRが中心になっています。いずれにせよ使用するのは細胞培養実験です。
The messenger RNA expression level of TMPRSS2 in VeroE6/TMPRSS2 cells is ∼10-fold higher than in normal human lung tissue and other human cell lines (Fig. 1A).
VeroE6/TMPRSS2細胞におけるTMPRSS2のメッセンジャーRNA発現量は、正常なヒト肺組織や他のヒト細胞株と比較して約10倍高い(図1A)。


VeroE6/TMPRSS2 cells are superior to other cell lines tested in this study for SARS-CoV-2 isolation.
VeroE6/TMPRSS2細胞は、SARS-CoV-2の分離において、本研究でテストした他の細胞株よりも優れている。


グラフも全部VeroE6/TMPRSS2細胞とやらが従来のVero細胞などと比較して優れているという説明です👇

The viral RNA copies in the clinical specimens used for virus isolation were estimated by real-time RT-PCR (9, 10). As expected, viral RNA copies in the clinical specimens in which CPE developed within 2 d p.i. were greater than those in the other specimens (Table 1).
ウイルス分離に用いた臨床検体中のウイルスRNAコピー数は,real-time RT-PCRで推定した(9, 10).予想通り、CPEが2日以内に発症した臨床検体のウイルスRNAコピー数は、他の検体のそれよりも多かった(表1)。


However, the viral RNA copies in the VeroE6/TMPRSS2 cell culture supernatants were >100 times greater than those from VeroE6 cells (Fig. 1 D and E).
しかし、VeroE6/TMPRSS2細胞の培養上清中のウイルスRNAコピーは、VeroE6細胞から得たものに比べて100倍以上大きかった(図1 DおよびE)。


The results showed that VeroE6/TMPRSS2 displayed ∼10-fold greater number of SARS-CoV-2–infected cells than the parental VeroE6 cells. 
その結果、VeroE6/TMPRSS2は、親細胞であるVeroE6に比べて、SARS-CoV-2感染細胞の数が約10倍多いことが分かった。


感染研論文の要旨は「VeroE6/TMPRSS2」は従来型のVero細胞よりも「結果」(CPE=細胞変性効果)が早くよく出るということのようで、分離した話よりそちらに重点が置かれています。


CPE=細胞変性効果とはVero細胞などがダメージを受ける(死ぬ)ことで、ウイルスの増殖が原因とされ(1)、ウイルス研究の世界ではこれをもって分離としています(2)
(1)細胞の死滅は「ウイルスの増殖」ではなく別の要因によるものです(後述)
(2)仮にウイルスが「増殖」したとしても、それはまだ混合物なので分離とは呼べません


分離が主題ではないからでしょうか、この論文のリンクは「分離に成功」ページではなく、こんな別のページ👇に目立たないように貼ってあります。

ふつう論文タイトルにリンクしますよね?それがなぜか掲載サイト名+日付に。
ここに日本の重要な「コロナ存在証明論文」があるなんて、一般の人はほとんど気付かないと思います。


さてその「VeroE6/TMPRSS2」は従来型Vero細胞より優れていると何度も強調した感染研論文、その最後はこう結ばれています👇
VeroE6/TMPRSS2 cells are easily maintained, suitable for large-scale propagation, and now available from Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) Cell Bank in Japan (https://cellbank.nibiohn.go.jp/english/) (JCRB no. JCRB1819).
VeroE6/TMPRSS2細胞は維持管理が容易で、大規模な増殖に適しており、現在、日本研究者生物資源コレクション(JCRB)細胞バンク(https://cellbank.nibiohn.go.jp/english/)(JCRB 番号 JCRB1819)から入手可能


これは論文の体裁をとったほとんど広告のようなもの…
「Vero細胞を使った”細胞培養”は分離とは言えない」と現在世界中で批判が高まる中、
「細胞培養は当研究所開発の新Vero細胞を使うと早く結果が出る」
とその購入先をお知らせするのがこの論文の要旨です🙃


★論文には難解な用語もたくさん出てきますが、全部を理解する必要はありません。私も全部はわかりませんし、それは厚労省や感染研の職員も同じだと思います。むしろ難解な用語や表現は一般人を煙に巻くための煙幕のようなものだと思ってください。


感染研の職員すらこのように言っています👇
📞国立感染症研究所の職員がすべてのことを知ってるとは限らないんですよ19:50~

「ワクチンに感染予防効果はない」ことすら知らなかったことについての弁解です。つまりこの「ウイルス」についてすべてを把握している人は感染研にもいないのです。


※このビデオで宮原さんはウイルスが分離された前提で「ではその病原性を証明してください!」と追及しています。しかしその後分離そのものが行われていないことが明らかになりました。


参考:ウイルス論文を見る時のポイントは分離(isolation)の項目にVero cells(Vero細胞)やCPE(細胞変性効果)cell culture(細胞培養)などの言葉があるかです。もしあればそれは分離ではなく細胞培養ですが、必ずあります。というのも👇

1954年以来、ウイルス分離と称して行われているのは「細胞培養」のみで、実際の分離は全く行われていないからです。
しかも細胞培養は対照実験が行われていない科学的に無効な実験なのです。

誰もしようとしない対照実験をステファン・ランカ博士が実際にやったところ、
ウイルスが入っているとされるサンプルなしでもVero細胞は死んでしまったのです。
「サンプル内のウイルスが増殖したせいでVero細胞は死ぬ」とされているのにです。
対照(コントロール)実験が公式に行われない理由はここにあります👇


分離と称して行われている「細胞培養」の問題点👇


この感染研論文について大橋眞教授はこう論評👇

シーケンス(遺伝子解析)の方も1行で片づけているとの指摘。論文のこの部分です👇
Next-generation sequencing (NGS) of case Wk-521 detected the nearly full-length genome sequence from SARS-CoV-2 with >99.9% homology (1, 2) (GISAID database ID EPI_ISL_408667).
症例Wk-521の次世代シーケンス(NGS)によりSARS-CoV-2のほぼ全長のゲノム配列が検出され、99.9%以上の相同性(1,2)を示した(GISAIDデータベースID EPI_ISL_408667)。


ここで大橋教授は
ウイルスを単離したわけではなく、PCR陽性の人から分離しただけです。
と述べていますが、この「分離」とは細胞培養(偽分離)を指しているようです。
※本来は分離=単離=純粋化


99.9%以上の相同性とは中国が最初に発表した論文の遺伝子データと99.9%以上一致したという意味です。
これは簡単に言うと、中国で最初に分離されたのとほぼ同じウイルスが日本で分離されたということです。しかし…


中国の最初の論文でも分離はされてないんでしたね👇


なお感染研は遺伝子データをGenBankから取り下げ(残っています)GISAIDにあるとしています(非公開なので本当にあるのか真偽不明ですが、あったとしても分離せずに作ったデータなので意味はありません)


【まとめ】感染研の論文にはざっとこのような問題点があります👇


①Vero細胞🐒を使った「細胞培養」であり、分離ではない
②分離方法の詳細な説明がない
③VeroE6/TMPRSS2という新型実験用細胞の広告のような論文である
④「分離論文」のはずなのに「分離に成功」ページにリンクされていない
⑤シーケンス方法の詳細な説明がない


2020年1月末にはさも快挙であるかのように報じられましたが👇

この内容では海外で検証の対象にならないのも無理はありませんね。


もう「感染研の開示請求回答」の解釈についての議論は終わりにしていいと思います。
「行政文書ではない」と不開示になった論文を読んだ結果はこれです👇
感染研はウイルス分離をしていません。
行なったのは細胞培養。
つまり行政文書かどうかにかかわらずウイルスの存在証明は実際にないのです。



🐒の腎臓細胞を使わない分離(つまり本当の分離)をした論文はないという回答👇


(分離と言っても実際には分離でないため)ウイルスの標本はないという回答👇


ここにも標本はないという回答👇


これは宮原さんが感染研から受け取ったメール👇

・詳細な臨床疫学的な情報
・近縁のウイルスによる感染症であるSARSとMERSの知見の蓄積


とあるのでその2つの文書の所在を開示請求したところ👇

何から何まで所在不明です・・・(感染研、MARSとスペルミス)


というかSARSもMERSも分離されていませんので👇
知見の蓄積も何もないと思います